TY - JOUR 
A1 - Hernández Gallardo, María Dolores
T1 - Obtención de una sonda de ARN para el diagnóstico del virus del mosaico del pepino dulce (PepMV) mediante hibridación molecular: seguimiento epidemiógico de la virosis en cultivos de tomato de la Región de Murcia
Y1 - 2009
UR - http://hdl.handle.net/10317/1804
AB - El Virus del Mosaico del Pepino Dulce (PepMV) detectado en Europa en 1999, está
causando importantes daños en las principales zonas productoras de tomate del Sureste
Español. Se transmite mecánicamente de forma eficiente, lo que ha promovido su rápida
expansión. Es por esto que, tras su aparición en la Región en el año 2000, se hizo preciso
un método de diagnóstico rápido y eficaz. La técnica hibridación molecular ha sido puesta a
punto para el seguimiento de la virosis en los cultivos de tomate de la Región. El primer objetivo fue la obtención de una sonda de ARN específica para su
detección. El trabajo se llevó a cabo en el laboratorio de virología del CSIC de la Estación
Experimental La Mayora, en Málaga, bajo la dirección del Dr. M. A. Aranda. A partir del ARN
de plantas de Nicotiana benthamiana inoculadas con un aislado de PepMV, conseguimos
amplificar un fragmento del ADN viral de unos 600 nucleótidos, mediante la técnica
Transcripción Inversa-PCR (RT-PCR) y usando cebadores específicos. Los cebadores
fueron diseñados sobre la única secuencia parcial del PepMV, de 584 nucleótidos, publicada
hasta el año 2001. Este fragmento fue ligado al plásmido pGEM-T y clonado en Escherichia
coli. A partir del fragmento clonado se desarrolló la sonda de ARN mediante una digestión
con la enzima de restricción ECO RI y posterior transcripción con la enzima SP6 RNA
polimerase. El marcaje de la sonda para su detección radiográfica se realizó en la reacción
de transcripción usando UTPs marcados con digoxigenina. Una vez desarrollada la sonda, se puso a punto la técnica de hibridación molecular
para el diagnóstico del virus y fue llevado a cabo un seguimiento de la enfermedad en
cultivos de tomate de la Región. Este trabajo fue realizado en el Instituto Murciano de
Investigación y Desarrollo Agroalimentario (IMIDA), en La Alberca (Murcia), bajo la dirección
del Dr. J. L. Cenis Anadón. Durante las campañas de verano 2001 y otoño-invierno 2001/02,
se prospectaron varios cultivos de tomate, al aire libre, bajo malla y bajo invernadero, en
diferentes zonas costeras del término municipal de Mazarrón y Lorca con características
productivas diferentes. Los seguimientos se realizaron cada dos semanas desde el
comienzo del cultivo hasta que éste se dio por concluido, tomando muestras al azar en cada
parcela, mediante la impresión de peciolos sobre una membrana de nylon positivamente
cargada, in situ, para su análisis en laboratorio por el método de hibridación molecular. Se
vio que en los cultivos de verano (2001), tanto al aire libre como bajo malla, la enfermedad
no aparecía hasta los meses de septiembre y octubre, con una incidencia que no superó en
la mayoría de las parcelas el 35%. En la campaña de otoño-invierno 2001/02, las primeras
manifestaciones del virus se dieron en los meses de noviembre y diciembre, al principio del
cultivo, con un 5-65% de plantas afectadas según parcelas. La enfermedad se extendió a lo
largo del ciclo de cultivo rápidamente, hasta afectar a todo el invernadero en los meses de abril y mayo. Se analizaron separadamente plantas injertadas y no injertadas, resultando
que el virus aparecía entre 15 y 20 días antes en las injertadas, que además alcanzan el
100% de infección antes que las plantas sin injertar. También fueron analizadas diferentes
especies de malas hierbas asociadas al cultivo, encontrándose el virus en Amaranthus
blitoides, Conyza bonariensis, Chenopodium album, Cyperus rotundus, Sisymbrium irio,
Malva parviflora y Solanum nigrum. Estas especies no están descritas en la bibliografía
como hospedantes de PepMV, por lo que serían necesarios análisis con técnicas más
sensibles para confirmar estos resultados. [ENG] Pepino mosaic virus was detected in Europe in 1999 and it is causing important
damages in the tomato-growing areas of the southeastern Spain. It is efficiently mechanically
transmitted, which has favored its rapid expansion. After its detection in Murcia in 2000, it
was necessary to develop a method to evaluate the virus incidence in the tomato crops.
The first objective of this project was to obtain an RNA probe that was specific for the
detection of this virus. It was carried out in the virology laboratory of the CSIC, ‘Estación
Experimental La Mayora’, in Málaga, under the direction of Dr. M.A. Aranda. Nicotiana
benthamiana plants were inoculated with a PepMV isolate from Murcia, and RNA was
isolated from them. Using this RNA and specific primers, a cDNA containing about 600 nt
was generated by RT-PCR. The primers were designed based on the unique PepMV partial
sequence of 584 nt available in 2001. This cDNA was cloned in Escherichia coli using the
plasmid pGEM-T as vector. An RNA probe was synthesized from the clone after it was
digested with the restriction enzyme ECO RI and transcripted using the SP6 RNA
polymerase. The probe was labeled using UTPs labeled with digoxigenin.After obtaining the probe, the molecular hybridization technique was optimized for the
diagnostic of PepMV and a study of the disease in several tomato crops in Murcia was
carried out. This work was done at the IMIDA (Instituto Murciano de Investigación y
Desarrollo Agroalimentario) in Murcia, under the direction of Dr. J.L. Cenis. During the
summer cycle in 2001 and autumn-winter cycle in 2001/2002, several tomato crops grown in
open field and under net and plastic greenhouses, were prospected in different coastal areas
of Mazarrón and Lorca with different production characteristics. Samplings were done every
2 weeks from the beginning to the end of the crop cycle. The samples were randomly
collected and the petioles were cut and impressed in situ in a nylon membrane positively
charged. Then, samples were analyzed by molecular hybridization in the lab. In the summer
plantings, the disease appeared in September and October, with an incidence lower than
35% in most of the crops. In the autumn plantings, the virus appeared in November and
December, at the beginning of the cultures, with a 5-65% of affected plants. The disease
expansion was very fast and a 100% level of infection was found in April and May. Grafted
and no grafted plants were analyzed separately and it was observed that PepMV appeared
15 to 20 days before in the grafted plants which reached a 100% level of infection faster than
no grafted plants. Some weeds species associated to these crops were also analyzed and
the virus was found in Amaranthus blitoides, Conyza bonariensis, Chenopodium album,
Cyperus rotundus, Sisymbrium irio, Malva parviflora y Solanum nigrum. But most of these
species are not described as PepMV hosts in the literature, so these results must be
confirmed by other more sensitive analysis
KW - Producción Vegetal
KW - Virus del Mosaico del Pepino Dulce (PepMV)
LA - spa
PB - María Dolores Hernández Gallardo
ER -