Estudio de nuevas herramientas para el fenotipado vegetal de alta resolución y sus aplicaciones en agricultura

Abstract

[SPA] El fenotipo es el conjunto de características observables producidas como resultado de la interacción entre el genotipo (conjunto de material genético) y el medioambiente. Por lo tanto, el fenotipado es el proceso por el que se determina el fenotipo de un organismo haciendo uso de diferentes tecnologías y herramientas, tales como análisis de imagen, estadística, inteligencia artificial, entre otros. En la antigüedad, el fenotipado era utilizado por los agricultores para obtener variedades mas deseables para la población de esa época al ir seleccionando y cruzando individuos. Hoy en día, sigue siendo una gran herramienta, tanto en laboratorio como en campo, sirviendo como indicador de alteraciones, que pueden ser internas (mutaciones o cruces) o externas (cambios en las condiciones ambientales, principalmente luz y temperatura). Las condiciones externas pueden ser captadas por la planta interviniendo en el desarrollo vegetal. Esto ocurre en ciertas rutas que están controladas por un reloj interno, conocido como reloj circadiano, que regula las respuestas biológicas de un conjunto de genes por señales externas. Estas suelen ser las variaciones de día/noche o los cambios estacionales permitiendo a las plantas adaptarse e, incluso, adelantarse a las nuevas condiciones del entorno. En la actualidad, la existencia de nuevas herramientas, como es la visión por computador, permite el desarrollo de nuevas técnicas para el fenotipado vegetal de una manera más sencilla y rápida. Además, no requieren de expertos en fenotipado, que podrían cometer fallos. Por otra parte, al agricultor o científico le puede resultar económicamente más rentable invertir en cierta maquinaria que la contratación de personal, aumentando los beneficios. En el caso del laboratorio, la visión por computador ha permitido la obtención de datos que antes no se pudieron describir por la carencia de herramientas capaces, como es el caso de la velocidad de movimiento o crecimiento por día o la dinámica de dichos movimientos. De igual forma, la inteligencia artificial ha permitido trabajar con esos datos con el fin de obtener herramientas de fenotipado automáticas. Por ello, ahora se puede obtener una interpretación más precisa de los comportamientos o cambios fenotípicos que suceden. Dentro de las nuevas técnicas que se pueden aplicar en el fenotipado, se puede destacar el uso de nuevos sistemas de iluminación más precisos, la visión artificial y la inteligencia artificial. En primer lugar, la modificación de la iluminación permite alterar los periodos de floración permitiendo obtener frutos fuera de temporada, como las fresas. De igual forma, sabiendo cuál es el mejor fotoperiodo, así como las longitudes de onda involucradas en el proceso o procesos que se quieren activar o reprimir, se puede modificar el comportamiento vegetal. Esto se muestra en el Capítulo I, donde se estudió el efecto de aumentar el fotoperiodo en el cultivo de fresas. Además, se estudiaron dos combinaciones de longitudes de onda distintas para comprobar cuál de ellas producía mejores resultados. La producción de fresas se incrementó al 300% en invernadero de investigación al aumentar la duración del fotoperiodo sin perder calidad. Estos estudios fueron también realizados en un invernadero comercial. En este caso, la producción total no aumentó, pero sí la cantidad de frutos de primera calidad, repercutiendo positivamente sobre el agricultor al tener un mayor beneficio por la misma producción. Por lo tanto, quedó demostrado cómo las condiciones externas son capaces de alterar el comportamiento vegetal y su utilización en agricultura para mejorar los cultivos. Otra herramienta útil es la visión por computador con la que, haciendo uso de distintos tipos de sensores, se permite obtener imágenes que el ojo humano es incapaz de ver, como es el caso de las cámaras hiperespectrales, térmicas o infrarrojas. El uso de estas nos permite visualizar sustancias, pigmentos o comportamientos no descritos previamente en la bibliografía. Estas imágenes se pueden procesar de manera manual, semi-automática o automática. Sin embargo, cuando se estudia el comportamiento vegetal a lo largo del tiempo suelen haber inconvenientes a la hora de crear herramientas automáticas. Esto se muestra en el Capítulo II, donde se expone la problemática de estudiar a lo largo del tiempo el desarrollo vegetal (velocidad de movimiento y crecimiento de distintos órganos), así como las estrategias para resolverlo. Para ello se trabajó con Petunia, Antirrhinum y Fragaria ananassa, tres especies vegetales con distintos patrones de crecimiento, lo que permite observar diferentes formas de abarcar los experimentos. Los parámetros elegidos para cada especie fueron distintos con el objetivo de dar una visión más completa de todas las posibilidades que tiene la visión por computador en el fenotipado. A parte de la velocidad de crecimiento y movimiento estudiadas en el capítulo anterior, en el Capítulo III se realizó un estudio para observar cómo utilizar la visión artificial en la detección de cambios en el comportamiento vegetal. En este caso, en la apertura floral de Petunia silvestre frente a una línea silenciada en el gen EARLY FLOWERING4 (ELF4) (RNAi:PhELF4). En este estudio se halló un comportamiento nunca antes descrito, al que se le ha puesto el nombre de floración en cadena. Este es un suceso que solo ocurre en las plantas silvestres y que podría actuar como un sistema de control para evitar el gasto excesivo de energía que tendría la apertura de varias flores a la misma velocidad y tiempo. Por lo tanto, las flores estarían en contacto entre ellas a través de un mecanismo aún desconocido en el que ELF4 o los genes que son activados por él están envueltos. En estudios previos ya se había comprobado en Arabidopsis cómo la ausencia de ELF4 aumenta la producción de CONSTANS (CO). Además, como esta floración en cadena estaba inhibida en las líneas silenciadas, se confirma la función del locus ELF4 en la floración. Para continuar con esta línea de investigación, se podría crear un programa automático para el análisis de apertura floral, el cual permitiría realizar un cribado en estudios de mutaciones, con el ahorro de tiempo y dinero que esto podría conllevar. Por lo tanto, este estudio muestra la capacidad del fenotipado para otras aplicaciones que no sean la selección de nuevas variedades. Como se ha comentado, la inteligencia artificial puede aplicarse junto a la visión artificial creando herramientas automáticas de fenotipado. Para poder hacerlas, se requiere la presencia de conjuntos de datos previos, como se muestra en el Capítulo IV con la creación de dos ground truth datasets. Un ground truth dataset se refiere a un conjunto de imágenes que están relacionadas con características medidas, en este caso fenotípicas y sirve para ajustar programas de inteligencia artificial, así como paa ayudar en la interpretación de resultados. Por un lado, se obtuvieron imágenes de flores de Antirrhinum, y, por el otro, de bayas de uva de distintas variedades haciendo uso de dos cámaras multiespectrales procurando evitar la presencia de brillos y sombras que hubieran disminuido la calidad de las imágenes. También se obtuvieron distintos datos fenotípicos medidos en laboratorio. En el caso de las flores, se midió la longitud, anchura, peso y contenido de antocianinas y, en las uvas, los grados brix y el contenido en antocianinas con el objetivo de poder hacer programas para hallar la etapa del desarrollo floral en el que la flor se encuentra, lo cual facilitaría y mejoraría la toma de datos en estudios científicos. En las uvas, el poder relacionar las imágenes con el contenido de grados brix y de antocianinas podría ser utilizado para la creación de herramientas automáticas en estudios de calidad, tanto para evitar el fraude alimentario como para ayudar a los agricultores de una manera no invasiva a saber el momento idóneo para la recolección. [ENG] Phenotype is composed by the observable characteristics produced by genotype (set of genetic material) and environment. Phenotyping is the process for determining organism´s phenotype using different technologies and tools, as image analysis with computer vision, statistics, artificial intelligence, among others. Farmers have always used phenotyping to select species and to obtain more desirable varieties according to population´s liking. Currently, it is used in laboratory and in open field for this purpose, but also the knowledge obtained after phenotyping can serve as an indicator of alterations. These may be due to internal (mutations or cross-breedings) or external modifications (changes in environmental conditions, such as light and temperature, mainly). External features affect plants because an internal clock, called circadian clock, regulates gene expression according to environmental signals (for instance, day/night or seasonal cycle) allowing plants to adapt and predict new conditions. As previously mentioned, the presence of new technologies, subsequently mentioned, opens the possibility to develop new systems for a more rapid and easier plant phenotyping. Furthermore, they do not need the use of professionals, who require a previous knowledge. Then, if the decision making is carried out by a machine, human mistake cannot happen. Consequently, investing in these kinds of gadgets can result cheaper than hiring professionals. In scientific research, these new tools allow to obtain data not described because of the impossibility of getting them previously. As a result, plant behaviour and phenotypic alterations can be better understood. Regarding to new techniques, it is worth mentioning the use of new lighting systems, computer vision, and artificial intelligence. Lighting modifications allow to alter flowering periods and, consequently, obtaining fruits out of harvest time. Indeed, knowing which photoperiod and wavelengths are involved in a specific plant process, which wants to be activated or inhibited, allows to use supplementary lighting to modify the normal plant behaviour. This is shown in Chapter I where the effect of increasing the photoperiod was studied. Moreover, two different combinations of wavelengths were analysed in order to test which one produced the best production. Strawberry production was enhanced up to 300% in a research greenhouse increasing daylength without losing fruit quality. These studies were also done in a commercial greenhouse. In this case, total production does not change, but amount of first quality fruits increases. Consequently, farmers can obtain more economic profits with the same crop. Therefore, the ability of external conditions to modify plant behaviour and its subsequent applications in agriculture were confirmed. Another useful tool is computer vision which acquires images that the human eye is unable to detect using different kinds of cameras, such as hyperspectral, thermal or infrared. Some examples are observing substances, pigments or behaviours not described previously. Although the aim is to automatically process these images, there are cases in which this is highly rough and the user prefers to do it manually or semi-automatically. Other drawback happens when plant behaviour is studied in time series, as showed in Chapter II, where this issue is addressed, as well as how to solve it. In the same way, it is showed how to process data from the images acquired for a more detailed analysis. Before doing this kind of experiment, it is also relevant to know the growth habit and which features want to be studied in order to adjust the vision system to these requirements. How to use computer vision to detect changes in plant behaviour is also observed in Chapter III. In this case, flower opening of Wild-type Petunia and Petunia RNAi:PhELF4. It was found a behaviour not described, called flowering in chain, which happened in wild-type organisms. This behaviour seems to be a control system to avoid high energy waste which could be produced by opening lots of flowers at the same speed and time. Therefore, it indicates that flowers should be in contact each others. This mechanism was unknown, so our results uncover a function of ELF4 in coordination of flower opening. Previous studies have already proved that mutants in ELF4 in Arabidopsis produced an increase in production of CONSTANS (CO). Moreover, this behaviour was inhibited in silenced lines confirming ELF4 as a gene involved in flower opening. In addition to this, if an automatic program was created to analyse flower opening, this would allow to do a screening in mutation studies saving time and money. This study also shows the ability of phenotyping in other approaches than selecting new varieties. As previously commented, artificial intelligence could be applied in combination with computer vision creating automatic phenotyping tools. In order to achieve automatic programs to study plant phenotype, the availability of ground truth datasets is crucial for algorithm development and testing. Ground truth datasets are sets of images related to real features enabling to calibrate programs or to help during the interpretation. Thus, Chapter IV describes the obtention of two ground truth datasets. Images from Antirrhinum flowers and grape berries of different varieties were obtained using two multispectral cameras. These images were acquired to avoid the presence of shines or shadows. In addition to the obtention of these images, additional phenotypic parameters were measured in the laboratory. In flowers, length, width, weight and anthocyanin content were measured. Therefore, the flower development stage could be detected with images using this ground truth dataset by creating an artificial intelligence program. In grapes, the features measured were brix degrees and anthocyanin content allowing to create tools to study quality fruit. Thus, new softwares could avoid food fraud or help farmers to know the appropriate moment to harvest in a noninvasive manner.