The anti-biofilm activity of essential oils on Listeria monocytogenesand Salmonella Enteritidis

Abstract

[SPA] La mayoría de los alimentos representan un entorno fértil para el crecimiento de bacterias patógenas. En condiciones poco higiénicas, la contaminación causada por estos microorganismos podría resultar en brotes de enfermedades de transmisión alimentaria que afecten a la salud pública. Además, esta contaminación puede causar importantes pérdidas económicas a las industrias al tener que retirar el producto del mercado, lo cual afectará notablemente a su reputación. Por esta razón, las buenas prácticas de higiene deben mantenerse y controlarse desde la granja hasta la mesa. En otras palabras, se debe aplicar una desinfección adecuada, una buena manipulación y se debe cumplir la normativa durante la producción, procesado, transporte, distribución, venta y consumo. Listeria monocytogenes y Salmonella Enteritidis son dos de los retos más importantes para la industria alimentaria por diferentes razones. La listeriosis tiene una de las tasas de mortalidad más alta respeto a otros patógenos alimentarios y podría llegar a ser letal para los grupos más vulnerables. Otro problema asociado con L. monocytogenes, es su capacidad de multiplicarse a temperaturas de refrigeración. Salmonella spp. ha sido vinculada con la mayoría de los brotes de intoxicación alimentaria en la Unión Europea, siendo S. Enteritidis la serovariedad más predominante. Además, la salmonelosis puede llegar a ser grave poniendo en peligro a los humanos. Ambos patógenos pueden introducirse en la cadena alimentaria a través de materias primas, trabajadores y otras fuentes, ya que viven en varios hábitats. Además de eso, pueden formar biofilms sobre diferentes superficies, lo que hace que su presencia sea muy preocupante. Los biofilms son comunidades microbianas complejas unidas entre sí por una matriz extracelular polimérica. Las células que forman parte de un biofilm son más resistentes que sus formas planctónicas. Por lo general, los biofilms se forman en zonas inaccesibles de las plantas de procesado, ya que estas áreas no siempre se limpian bien. Por lo tanto, pueden persistir durante mucho tiempo provocando problemas y contaminación. Se ha aplicado protocolos de limpieza y desinfección empleando varios productos comerciales con el objetivo de eliminar los biofilms. Sin embargo, el uso de estos productos está cuestionado, ya que acarrea algunos problemas adicionales. Primero, su uso repetido y especialmente la exposición a concentraciones subletales pueden generar resistencia. En segundo lugar, este tipo de sustancias químicas no son muy respetuosas con el medio ambiente, lo que las convierte en poco deseables. Así pues, la investigación y la búsqueda de alternativas naturales se ha ido incrementando año tras año para responder a las demandas del consumidor. Entre estas alternativas, los aceites esenciales (AE) se consideran una opción natural y ecológica. La actividad de estas sustancias volátiles y aromáticas se ha descrito ampliamente en la literatura. Entre los AE, los de canela, clavo, cebolla y ajo han sido utilizados en diferentes culturas, en forma de aditivos naturales, para prevenir el deterioro de los alimentos. Además, varios estudios indican su actividad antimicrobiana frente a varios microorganismos. En cambio, su actividad anti-biofilm no ha sido completamente investigada, lo que los hace muy interesantes de explorar. El objetivo de esta tesis fue estudiar la capacidad inhibitoria de diferentes aceites esenciales sobre diferentes etapas de la formación de los biofilms por parte de L. monocytogenes y S. Enteritidis. Para lograr este objetivo general, se establecieron varios objetivos parciales: 1) evaluar la actividad antibacteriana de los cuatro aceites esenciales frente a L.monocytogenes y S. Enteritidis; 2) establecer la concentración mínima inhibitoria (CIM) de cada AE frente a ambos microorganismos; 3) evaluar el efecto de las diferentes dosis (0,5CMI, CMI y 2CMI) sobre la etapa inicial de formación del biofilm; 4) evaluar el efecto de las diferentes dosis (0,5CMI, CMI y 2CMI) sobre la erradicación de los biofilms; 5) realizar el análisis químico de los diferentes AE para caracterizar sus compuestos mayoritarios. Los AE se analizaron mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) para identificar los principales componentes presentes. La actividad antibacteriana se determinó mediante dos ensayos con el fin de evaluar la sensibilidad de los microorganismos a los AE seleccionados. El primero fue el método de difusión en agar, con el que se midieron los halos de inhibición (HI). El diámetro del HI se relacionó después con la susceptibilidad de la cepa al AE. El segundo experimento fue la determinación de la CMI. Para este ensayo, las bacterias se incubaron durante 18 horas con concentraciones decrecientes del AE. La concentración más baja del AE que inhibió el crecimiento de las bacterias, se consideró como la CMI. Posteriormente se investigó la actividad anti-biofilm. Para empezar, se efectuó el estudio del efecto de los AE sobre la adhesión inicial. Los AE se incubarona 37°C durante 24 horas junto con los cultivos a diferentes dosis (0,5CMI, CMI y 2CMI) en placas de poliestireno de 96 pocillos. Luego, se realizó el ensayo de los mismos AE pero sobre los biofilms previamente formados. Para este ensayo, L. monocytogenes y S. Enteritidis se dejaron crecer previamente para obtener una adherencia, más o menos fuerte. Posteriormente, se añadieron los AE a diferentes dosis (0,5CMI, CMI y 2CMI) a los pocillos y se midió la densidad óptica tras1, 5 y 20 horas de incubación con los aceites esenciales. Finalmente, la biomasa de los biofilms se midió mediante tinción con cristal violeta. Los análisis cromatográficos realizados han mostrado que los tiosulfatos son los principales componentes presentes en los aceites esenciales de ajo y cebolla, mientras que el cinamaldehído fue el componente mayoritario del AE de canela y el eugenol el del AE de clavo. En el método de difusión en agar, el AE de cebolla fue el más inhibidor frente a L. monocytogenes, exhibiendo el HI más alto (37,8 ± 0,4 mm) y el AE de clavo para S. Enteritidis (HI = 12,3 ± 0,4 mm). Para la CMI, en el caso de L. monocytogenes, el AE de canela y el AE de ajo exhibieron el mismo valor (0,1 mg mL−1), mientras que el AE de cebolla y el de clavo tuvieron respectivamente valores de 0,025 y 0,05 mg mL-1. Para S. Enteritidis, el AE de cebolla y el de ajo mostraron el mismo valor: 0,4 mg mL−1. Por otro lado, el AE de canela y el de clavo mostraron un valor de 0,2 y 0,1 mg mL1 respectivamente. La inhibición de la adhesión inicial fue muy alta a una dosis CMI, oscilando entre el 61% y el 100% para L. monocytogenes, mientras que para S. Enteritidis varió del 50% al 65%. Tras una hora de incubación con los AE, la inhibición de los biofilms preformados se encontró entre el 67,7% y el 52,5% para L. monocytogenes, mientras que para S. Enteritidis estaba entre el 40,2% y el 20,3%. Las conclusiones más significativas de esta tesis fueron: 1) el efecto de los aceites esenciales fue mayor sobre L. monocytogenes que sobre S. Enteritidis en todos los casos; 2) el efecto antibiofilm dependió de la dosis; 3) el porcentaje de inhibición fue más alto sobre la adhesión inicial que sobre los biofilms previamente formados. En definitiva, esta investigación ha revelado el potencial de estos aceites esenciales como agentes anti-biofilm, lo cual puede resultar de gran ayuda para la industria alimentaria. [ENG] Most foods represent a fertile environment for pathogenic bacteria growth. When the hygienic conditions are missing, the contamination caused by these microorganisms can result in foodborne diseases and outbreaks affecting public health. Also, this contamination can cause important economic losses to food industries in terms of recalls affecting their reputation in the market. For this reason, good hygienic practices have to be held and controlled from farm to fork. In other words, proper disinfection, careful manipulation and the respect of regulations have to be applied during production, processing, shipping, distribution, retail and consumption. Listeria monocytogenes and Salmonella Enteritidis represent two of the most challenging pathogens for food processing environments for different reasons. Listeriosis has a higher fatality rate than other foodborne illnesses and could be mortal for vulnerable groups. Another problem associated with L. monocytogenes, is its ability to grow at refrigeration temperatures, which poses a challenge to food manufacturers and consumers. Salmonella spp. have been predominant in food poisoning outbreaks with S. Enteritidis being the most reported serovar. Also, this microorganism can lead to mild to severe symptoms in humans. Both food pathogens can be introduced in the food chain through raw material, workers and other sources as they habit a wide range of niches. Added to that, they are able to form biofilms on different surfaces making their presence yet very challenging. Biofilms are complex microbial communities formed into an extracellular matrix and they are more resistant forms than their planktonic counterparts. They are formed usually in inaccessible parts of manufacturing plants, as these areas are not well cleaned. Therefore, they can persist for a long time causing problems and contamination. In order to get rid of biofilms, many different cleaning and disinfection protocols have been applied with the use of a wide range of commercial products. However, many of these products can be controversial as they can have various side effects. First, the repetitive use and especially the exposition to sub-inhibitory concentrations can generate resistance by modifying some genes and leading to an increased tolerance. Second, the environmental impact of this kind of chemicals makes them undesirable. Therefore, the investigation for natural alternatives has been increasing every year in order to respond to the consumer’s demands. Among these alternatives, essential oils (EOs) are considered as an eco-friendly and natural option. The activity of these volatile and aromatic products has been widely described in literature. Among them, the essential oils of cinnamon, clove, onion and garlic have been used in different cultures, as well as in the food industry as natural flavorings and preservative agents against food spoilage. Also, they have been reported for their antimicrobial action against several foodborne pathogens. However, their anti-biofilm activity has not been fully investigated, which make them interesting to explore. The objective of this thesis was to explore the capacity of different essential oils to inhibit different stages of biofilm formation by L. monocytogenes and S. Enteritidis. To achieve this general aim, several goals were established: 1) evaluate the antibacterial activity of the four essential oils against L. monocytogenes and S. Enteritidis; 2) establish the minimal inhibitory concentration of every EO against both microorganisms; 3) assess the effect of MIC-related doses on the initial cell attachment; 4) assess the effect of the MIC-related doses on biofilm eradication; 5) perform the chemical analysis of the different EOs in order to characterize the bioactive compounds. The analysis of the EOs was done by gas chromatography - mass spectrometry (GC-MS) in order to identify the major components implicated. The antibacterial assays were performed by two experiments in order to assess the sensibility of the microorganisms to the EOs selected. The first one consisted in the disc diffusion assay where the inhibition zones (IZ) were measured. The second experiment was the determination of the MIC. During this step, the bacteria were incubated overnight with different concentration of the different EOs. So, the lowest concentration that prevented the pathogen growth was considered as the MIC. Afterwards, the antibiofilm assays were performed. Firstly, the effect of the EOs was experimented against the inhibition of the initial cell attachment. The EOs were pipetted together with bacterial cultures at different doses (0.5 MIC, MIC and 2MIC) into the 96- well plates. Then, they were incubated at 37°C for 24 hours. Secondly, the eradication assay was done in order to explore the effect of EOs on preformed biofilms. L. monocytogenes and S. Enteritidis were left to grow for initial cell attachment. Afterwards, the EOs were added at different doses (0.5 MIC, MIC and 2MIC) to the wells and left for 1, 5 and 20 hours. Finally, the biofilm’s biomass was assessed by the crystal violet assay. The chemical analysis carried out revealed that thiosulfates were the major compounds present in the EOs of garlic and onion. Added to that, E-cinnamaldehyde and eugenol were the major compounds for cinnamon and clove respectively. Concerning disk diffusion assay, the EO of onion was the most inhibitory for L. monocytogenes, exhibiting the highest IZ (37.8 ± 0.4 mm) and the EO of clove for S. Enteritidis (IZ = 12.3 ± 0.4mm). For the MIC, in the case of L. monocytogenes, EO of cinnamon and EO of garlic displayed an identical value (0.1 mg mL−1). On the other hand, EO of onion and EO of clove, had respectively a value of 0.025 and 0.05 mg mL-1. For S. Enteritidis, EO of onion and EO of garlic displayed the same value: 0.4 mg mL−1. On the other hand, the EO of cinnamon and the EO of clove showed a value of 0.2 and 0.1 mg mL−1 respectively. The inhibition of initial cell attachment was high at MIC dose, ranging from 61% till 100% for L.monocytogene, while for S. Enteritidis ranged from 50% to 65%. At one hour incubation with the EOs, the inhibition of preformed biofilms at MIC ranged from 67.7% till 52.5% for L. monocytogenes while for S. Enteritidis ranged from 40.2% to 20.3 %. The most significant conclusions from this thesis were: 1) the effect of essential oils was higher on L. monocytogenes than in S. Enteritidis in all cases; 2) the antibiofilm effect was dose dependent; 3) the inhibition rate was high on initial cell attachment, but lower on preformed biofilms. This research has revealed the potential use of these essential oils as antibiofilm agents for the food industry.