Variability in the response of salmonella and listeria strains to different strategies for inactivation

Abstract

[ENG] The last EFSA report, notified a total of 5146 food outbreaks in the European Union in 2018. The food industry plays an important role in the food chain and has to adapt and reinvent itself when consumers place certain demands on products. Food safety is the first issue to take into account. There is already a large variety of microbiological species that are capable of developing in food and the safety of food makes it questionable whether or not the product is suitable for consumption. Listeria monocytogenes and Salmonella spp. are characterised by being two ubiquitous microbial species capable of living in borderline conditions of pH, water activity and sodium chloride concentrations. Another circumstance of these two microorganisms is the variability between their different strains and the capacity they have to recover from the different stresses to which they are subjected. For these reasons, it is of utmost importance to know their response to stress in order to control their inactivation and/or development in any situation. This knowledge will enable to efficiently apply technologies and treatments that are capable of inactivating or inhibiting growth of microorganisms, so to prevent or, at least, reduce food contamination. So, in this thesis, the main objective was to study the application of different strategies for the inactivation of L monocytogenes and Salmonella that could reduce the intensity of the treatments, while ensuring food safety. In this thesis, the effect that different inactivation strategies have on L. monocytogenes and Salmonella spp. has been studied. Firstly, the heat resistance of four L. monocytogenes strains -Scott A, CECT 4031, CECT 4032 and 12MOB052- in three different matrices -buffered peptone water (BPW), pH 7 Mcllvaine phosphate citrate buffer and a last one of food origin; semi- skimmed milk- was studied. Under isothermal conditions, there was no between-strains and between-media variability in the resistance. However, when this experiment was carried out under dynamic conditions, some strains were able to develop acclimation to stress, leading to important differences in resistance. Between-strains, the CECT 4031 increased its D-value by 10, with CECT 4032 being the least acclimated and between-media, peptone water buffer and semi- skimmed milk were the mediums where most acclimation was found. These results are of great importance, as they highlight that some mechanisms of heat resistance may not be detected when conditions, such as acclimation.Another part of the research was carried out to evaluate the response to heat when Salmonella Senftenberg and S. Enteritidis - the treatment applied is under isothermal conditions, but they show up under dynamic heating were exposed to a previous acid shock. Both serovars of Salmonella were grown at pH 4.5 and subsequently exposed to heat treatment under isothermal conditions at four different temperatures. The heating medium used was peptone water at pH 4.5 and 7.0. The results showed that both serovars had a different response to a heat treatment after the exposure to acid. On the one hand, S. Senftenberg reduced its heat resistance when subjected to a previous acid shock, while in S. Enteritidis its heat resistance increased. Again, these results bring out the inherent variability in microorganisms, in this case related to a stress response mechanisms. Finally, the effectiveness of the combination of applying electrical pulses (PEF) and oregano essential oil to L. monocytogenes was determined. The medium used was a Mcllvaine buffer at pH 7 with a conductivity of 6 μS/cm. On the one hand, the efficiency of the electric field was evaluated between 5 and 20 kV/cm and it was found that after 60 pulses at 20 kV/cm field strength, 1 Hz frequency and 20 μs pulse width, an inactivation of 2.01 log10 cycles was achieved, while to achieve a similar level of inactivation at 15 kV/cm, 300 pulses were required. Then, PEF treatments were then applied (20 kV/cm field strength, 60 pulses, 1 Hz frequency and 20 μs pulse width) after having exposed the cells to the minimum inhibitory concentration (MIC) of the oregano essential oil (2000 ppm) and these results showed no significant differences (p>0.05) with respect to the PEF treatments applied alone. However, when the same PEF treatment as above was applied first and then the surviving microorganisms were resuspended on the MIC of oregano essential oil, significant differences (p<0.05) were found with respect to PEF applied alone and PEF after the oregano. It was also found that reducing to 1/16 the MIC (125 ppm) the effect was the same as if we applied the MIC. To conclude, this thesis has explored how different strategies for microbial inactivation can be combined to produce a safe food with a milder treatments than required in a single contribution to the food industry will improve the quantification of microbiological risk assessment. [SPA] El último informe de la EFSA reportó un total de 5146 brotes de alimentos en la Unión Europea en 2018. La industria alimentaria desempeña un papel importante en la cadena alimentaria y tiene que adaptarse y reinventarse cuando los consumidores plantean ciertas exigencias a los productos. La inocuidad de los alimentos es la primera cuestión que hay que tener en cuenta. Ya existe una gran variedad de especies microbiológicas capaces de desarrollarse en los alimentos y la inocuidad de los alimentos hace que sea cuestionable si el producto es apto o no para el consumo. Listeria monocytogenes y Salmonella spp. se caracterizan por ser dos especies microbianas ubicuas capaces de vivir en condiciones límite de pH, actividad del agua y concentraciones de cloruro de sodio. Otra circunstancia de estos dos microorganismos es la variabilidad entre sus diferentes cepas y la capacidad que tienen para recuperarse de las diferentes tensiones a las que están sometidos. Por estas razones, es de suma importancia conocer su respuesta al estrés para controlar su inactivación y/o desarrollo en cualquier situación. Este conocimiento permitirá aplicar eficazmente tecnologías y tratamientos capaces de inactivar o inhibir el crecimiento de los microorganismos, para así prevenir o, al menos, reducir la contaminación de los alimentos. Así pues, en esta tesis, el objetivo principal fue estudiar la aplicación de diferentes estrategias para la inactivación de L monocytogenes y Salmonella que pudieran reducir la intensidad de los tratamientos, garantizando al mismo tiempo la inocuidad de los alimentos. En esta tesis se ha estudiado el efecto que tienen diferentes estrategias de inactivación sobre L. monocytogenes y Salmonella spp. En primer lugar, se ha estudiado la resistencia al calor de cuatro cepas de L. monocytogenes -Scott A, CECT 4031, CECT 4032 y 12MOB052- en tres matrices diferentes -agua de peptona tamponada (BPW), tampón de fosfato de Mcllvaine de pH 7 y una última de origen alimentario; leche semidesnatada. En condiciones isotérmicas, no hubo variación de la resistencia entre las cepas y entre los medios. Sin embargo, cuando este experimento se llevó a cabo en condiciones dinámicas, algunas cepas fueron capaces de desarrollar una aclimatación al estrés, lo que dio lugar a importantes diferencias en la resistencia. Entre las cepas, la CECT 4031 aumentó su valor D 10 veces, siendo la CECT 4032 la menos aclimatada, y entre los medios, el tampón de agua de peptona y la leche semidesnatada fueron los medios en los que se encontró mayor aclimatación. Estos resultados son de gran importancia, ya que ponen de manifiesto que algunos mecanismos de resistencia al calor pueden no detectarse cuando el tratamiento aplicado es en condiciones isotérmicas, pero aparecen en condiciones de calentamiento dinámico, como la aclimatación. Otra parte de la investigación se llevó a cabo para evaluar la respuesta al calor cuando Salmonella Senftenberg y S. Enteritidis fueron expuestos a un choque ácido previo. Ambos serovares de Salmonella se cultivaron a un pH de 4,5 y posteriormente se expusieron a un tratamiento térmico en condiciones isotérmicas a cuatro temperaturas diferentes. El medio de calentamiento utilizado fue agua de peptona a pH 4,5 y 7,0. Los resultados mostraron que ambos serovares tuvieron una respuesta diferente al tratamiento térmico después de la exposición al ácido. Por un lado, S. Senftenberg redujo su resistencia al calor cuando se sometió a un choque ácido previo, mientras que en S. Enteritidis su resistencia al calor aumentó. Una vez más, estos resultados ponen de manifiesto la variabilidad inherente en los microorganismos, en este caso relacionada con los mecanismos de respuesta al estrés. Por último, se determinó la eficacia de la combinación de la aplicación de pulsos eléctricos (PEAV) y aceite esencial de orégano a L. monocytogenes. El medio utilizado fue un tampón de Mcllvaine a pH 7 con una conductividad de 6 μS/cm. Por un lado, se evaluó la eficiencia del campo eléctrico entre 5 y 20 kV/cm y se constató que después de 60 pulsos a 20 kV/cm de intensidad de campo, 1 Hz de frecuencia y 20 μs de ancho de pulso, se logró una inactivación de 2,01 log10 ciclos, mientras que para lograr un nivel similar de inactivación a 15 kV/cm se necesitaron 300 pulsos. A continuación, se aplicaron tratamientos PEAV (intensidad de campo de 20 kV/cm, 60 pulsos, frecuencia de 1 Hz y anchura de pulso de 20 μs) después de haber expuesto las células a la concentración mínima inhibitoria (CMI) del aceite esencial de orégano (2000 ppm) y estos resultados no mostraron diferencias significativas (p>0,05) con respecto a los tratamientos PEAV aplicados solos. Sin embargo, cuando se aplicó primero el mismo tratamiento PEAV que el anterior y luego se resuspendió a los microorganismos sobrevivientes en la CIM del aceite esencial de orégano, se encontraron diferencias significativas (p<0,05) con respecto al FEM aplicado solo y al PEAV después del orégano. También se encontró que al reducir a 1/16 la CIM (125 ppm) el efecto fue el mismo que si aplicáramos la CIM. Para concluir, esta tesis ha investigado cómo pueden combinarse diferentes estrategias de inactivación microbiana para conseguir un alimento seguro con un tratamiento más suave, que en un solo tratamiento convencional. También ha ayudado a abordar las predicciones para futuros estudios y como contribución a la industria alimentaria mejorará la cuantificación de la evaluación de riesgos microbiológicos.