Genetic structure of scent profiles in antirrhinum : implications for the evolution and Interaction with pests and pollinator

Abstract

[SPA] Los olores son caracteres fenotípicos distintivos que pueden ser utilizados para caracterizar especies. Combinaciones de Compuestos Orgánicos Volátiles (COVs) intervienen en las interacciones entre plantas y otros reinos. Los aromas florales juegan un papel importante en la polinización y la supervivencia de las especies. Los COVs emitidos por las plantas se pueden agrupar en dos clases: compuestos que son emitidos constitutivamente y que forman parte del perfil aromático de la planta, órgano o tejido y compuestos que no se emiten constitutivamente y que son el resultado de la inducción de ciertas rutas del metabolismo secundario. En el análisis no específico de los metabolomas volátiles se generan cantidades considerables de datos. En este sentido, la automatización de los resultados obtenidos por gases masas y espectrometría de masas (GC-MS) es necesaria para facilitar el análisis de un mayor número de muestras. El análisis comparativo de los perfiles aromáticos se puede realizar utilizando distintos métodos de semi-cuantificacion que proporcionan información acerca de las proporciones relativas de COVs. Se caracterizó la emisión de aromas durante el desarrollo de las flores de ocho especies silvestres: Antirrhinum linkianum, A. tortuosum, A. cirrigherum, A. latifolium, A. meonanthum, A. braun-blanquetii, A. barrelieri, y A. graniticum; además de dos líneas consanguíneas de A. majus, 165E y Sippe50. La emisión total vario entre las especies y durante el desarrollo de las flores. Utilizando los perfiles aromáticos, en general, las especies se agruparon de acuerdo a la actual filogenia. En contraste, el análisis de clústeres de los COVs no se agrupo de acuerdo a las rutas metabólicas, lo que indica el papel relevante de los perfiles aromáticos como mezclas específicas en Antirrhinum. Por otro lado, realizamos un análisis genético de A. linkianum y A. majus (165E). Analizamos sus emisiones contrastantes de metil benzoato, metil cinamato, acetofenona y ocimeno. El estudio se basó en la segregación de estos volátiles en una población F2. Los resultados indicaron que la emisión de estos compuestos se atribuye a uno o dos loci con interacciones simples o epistáticas. Metil benzoato se emite principalmente en plantas de A. majus y no en A. linkianum. Siguiendo un enfoque de gen candidato, se halló que la BENZOIC ACID CARBOXYMETHYL TRANSFERASE (BAMT) de A. linkianum era un alelo nulo. Nuestros resultados indican que cambios considerables en la zona promotora, que incluyen la inserción de un transposon IDLE MITE en A. linkianum BAMT, causan su falta de emisión de metil benzoato. Cambios en genes aislados involucrados en la biosíntesis de volátiles (como la metilación del ácido benzoico) establecen las diferencias en la emisión de aromas entre estas dos especies. La cuantificación de los COVs emitidos requiere, idealmente, del uso de estándares químicos y de curvas de calibrado. Sin embargo, la composición aromática es impredecible y no hay estándares para cada volátil hallado. En el análisis de perfiles aromáticos es más relevante la abundancia relativa de los compuestos que las abundancias absolutas de los mismos. Se compararon siete métodos semi-cuantitativos diferentes. Además, se estudió el uso de los componentes más cercanos y de calibradores únicos para la semi-cuantificacion. Se encontró que cualquiera de los métodos basados en estándares obtuvieron resultados similares o idénticos cuando se comparaba con las cuantificaciones por estándares verdaderos, excepto en el método de adición estándar. Se discuten las ventajas y desventajas de cada método con respecto a la precisión, variabilidad experimental, aceptación y cantidades obtenidas. Se desarrolló gcProfileMakeR, un paquete de R que usa archivos obtenidos habitualmente por GC-MS y los utiliza como archivos de entrada para producir una lista de compuestos volátiles constitutivos y no constitutivos como resultado. Utilizando tres funciones, el programa define el número y la identidad de los compuestos presentes en cada muestra y entre las muestras. Finalmente, establece los umbrales de calidad y de presencia requeridos para agrupar los compuestos hallados. Los metabolitos son agrupados en tres categorías: Perfil, No-Constitutivos por Frecuencia y No-Constitutivos por Calidad. Como prueba de concepto, definimos el volatiloma floral de los mutantes de A. majus compacta (co) y deficiens-nicotianoides (def-nic). Nuestros resultados muestran diferencias sustanciales en la composición de COVs emitidos por las flores. Se estudiaron las preferencias de plagas y polinizadores por distintos y distintivos perfiles aromáticos de A. majus, A. linkianum y cuatro líneas recombinantes consanguíneas (RILs). Como plaga, se utilizó Frankliniella occidentalis mientras que como polinizador se utilizó Bombus terrestris audax. Se estableció el volatiloma constitutivo de las líneas analizadas con gcProfileMakeR. Se encontró que los abejorros eran atraídos por metil benzoato y los trips son ahuyentados por ð€‰´-myrceno. Además, se identificaron compuestos que pueden actuar como potenciadores de los efectos atrayentes o repelentes cuando actúan en combinación con otros COVs. Del trabajo llevado a cabo en esta tesis doctoral se obtienen varias conclusiones generales. Por un lado, los perfiles aromáticos de las flores de Antirrhinum son característicos de las especies estudiadas y pueden ser el resultado de adaptaciones locales a plagas y polinizadores. Además, los transposones son intermediarios relevantes que median en la evolución, ya que pueden afectar a la emisión de volátiles clave en la atracción de polinizadores, como metil benzoato. Los COVs son mediadores importantes en las interacciones entre plantas e insectos, tanto como compuestos clave o como mezclas específicas de aromas. El desarrollo de nuevas herramientas que permiten el análisis de un mayor número de muestras y un consenso general de los métodos de semi-cuantificacion a utilizar, estimulara la reproducibilidad de los datos obtenidos. Los programas de mejora genética deberían de tener en cuenta los resultados relacionados con el efecto de los volátiles sobre las preferencias de los insectos para mejorar la defensa innata de los cultivos, las producciones y la calidad de los frutos.

[ENG] We developed gcProfileMakeR, an R package that uses common output files from GC-MS as inputs and provides a list of core and non-constitutive volatiles as outputs. By using three functions, the program defines the number and identity of compounds present in each sample and between samples, and finally establishes the thresholds of quality and presence required for grouping VOCs. Metabolites are grouped into three categories, Profile, Non-Constitutive by Frequency and Non-Constitutive by Quality. As a proof of concept, we define the floral volatilomes of A. majus compacta (co) and deficiens-nicotianoides (def-nic) mutants. Our results show substantial differences in the composition of VOCs emitted by the flowers. We tested the preferences of pests and pollinators for distinctive and different floral scent profiles from A. majus and A. linkianum, and from four recombinant inbred lines (RILs). As pest, we used Frankliniella occidentalis whereas as pollinator we used Bombus terrestris audax. We established the core volatilome of plant lines by using gcProfileMakeR. We found that bumblebees are attracted by methyl benzoate and thrips are repelle by ð€€„ -myrcene. Furthermore, we identified compounds that may act as enhancers of attraction/repellence effects on insects when acting in combination with others. From the work carried out in this PhD dissertation we can draw some general conclusions. Firstly, floral scent profiles are characteristic of Antirrhinum species and may be the result of local adaptation to pests and pollinators. Transposons are relevant intermediaries mediating evolution given that they can affect the emission of key volatiles mediating pollinator attraction, such as methyl benzoate. VOCs are important mediators in plant-insect interactions both as key compounds and as blends of scents. The development of new tools that allow the analysis of a higher number of samples and a general agreement on the semi-quantification methods to be used will enhance the reproducibility of data. Breeding programs should take into account results related to the effect of floral VOCs on insect preferences in order to improve the innate defence of crops, yield productions and fruit quality.