Identification of novel genes involved in petunia flower development using transcript profiling and reverse genetics

Abstract

[ENG] Petals are a key element on plant life cycle as, in many species, they attract pollinators, thus aiding to reproduction. Furthermore, they have economic importance in ornamental crops. In the present study, petal transcriptional patterns were compared within the ower organs in Arabidopsis thaliana. It was found that catalytic molecular functions were overrepresented in petals. A shortlist comprising the top ten di_erentially expressed genes in petals were mapped to the model species with industrial value Petunia hybrida, and further downregulated by RNAi. The silencing phenotypes found permitted to assign functions in petal development to seven novel genes: when silenced, they triggered alterations on ower size and shape (PhCYP76, PhNPH3, PhFeSOD, PhXTH, PhCYP96 and PhWAK), petal smoothness (PhPRA), color (PhNPH3 and PhWAK) and symmetry (PhCYP76). Pleiotropic phenotypes were found, such as changes in root morphology and leaf color (PhCYP76), ower number, capsule and seed morphology (PhCYP96) and plant height (PhCYP76 and PhCYP96). To accomplish the experimental design, three methods were developed. First, the \pESTle" management system that assembles, annotates, stores and serves expressed sequence tag data. Second, a reference gene selection for real time PCR experiments that includes a new method for stability estimation based on rank aggregation of published algorithms, and concludes that a normalization factor with two members of EF1_, SAND, CYP or RAN1 is stable enough under most conditions. And third, a PCR e_ciency estimator based on amplicon characteristics which allows e_ciency-driven primer design in a Web tool. [SPA] La corola es un elemento básico en el ciclo de vida vegetal puesto que, en muchos casos, atrae a polinizadores que intervienen en su propagación. Además, posee un valor económico en especies ornamentales. En el presente trabajo se realizó un análisis comparativo contrastando el transcriptoma de pétalos frente al resto de órganos orales de Arabidopsis thaliana. Como resultado se observó la preponderancia de genes involucrados en funciones catalíticas. Aún de dilucidar el rol de estos genes, se escogieron aquellos nueve con mayor expresión diferencial y se silenciaron de forma estable mediante ARN de interferencia. De esta forma, el análisis fenotípico ha permitido asignar un papel a siete nuevos genes: al ser silenciados, provocan alteraciones en la forma y tamaño (PhCYP76, PhNPH3, PhFeSOD, PhXTH, PhCYP96 y PhWAK), textura (PhPRA), color (PhNPH3 y Ph- WAK) y simetría (PhCYP76) de los pétalos; así como el color de las hojas y la morfología radicular (PhCYP76), el número de ores y la altura de la planta (PhCYP76 y PhCYP96). Aún de respaldar el diseño experimental se desarrollaron tres métodos. En primer lugar, el gestor _pESTle_, que aúna el ensamblaje, anotación, almacenamiento y difusión de ESTs. En segundo lugar, la selección de genes de referencia para PCR en tiempo real, que reúne un nuevo método para su evaluación basado en la agregación de rangos; y la descripción de la pertinencia de emplear un factor de normalización con dos genes de entre EF1_, SAND, CYP y RAN1 en la mayor parte de los casos. Finalmente, se produjo el estimador _pcrE_ciency_, que proporciona un entorno de diseño de cebadores que simultáneamente predice su eficiencia.